人Spsb1基因慢病毒干擾載體的構建及病毒包裝

摘要：目的：構建人Spsb1基因的shRNA慢病毒干擾載體,為研究該基因在肝癌細胞生長、增殖、轉移和浸潤中的作用打下前期基礎。方法：根據shRNA的設計原則設計一段shRNA和陰性對照shRNA,化學合成DNA雙鏈中的兩條單鏈,通過退火和配對后與慢病毒干擾載體LV-3（p GLVH1/GFP＋Puro）連接,陽性克隆子LV3-Spsb1測序鑒定;將LV3-Spsb1和輔助質粒p CMV-delta8.91/p CMV-VSVG共轉染HEK293T細胞,轉染后24 h在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率;用轉染后收集到的病毒液感染肝癌細胞SMMC-7721,熒光顯微鏡下觀察細胞熒光;用1 mg/L嘌呤霉素殺死未感染的細胞,Western blot檢測細胞內源性Spsb1基因表達量。結果：測序鑒定證明獲得的LV3-Spsb1質粒是所需要的目的慢病毒shRNA干擾載體;通過與輔助質粒共轉染HEK293T細胞后,細胞在熒光顯微鏡下發出明亮的綠色熒光,提示細胞轉染效率較高;病毒液感染SMMC-7721后,細胞內出現綠色熒光,證明共轉染系統可以成功包裝shRNA-Spsb1重組慢病毒顆粒;Western blot結果顯示shRNA-Spsb1重組慢病毒能夠抑制細胞內Spsb1基因表達,證明shRNA-Spsb1的確可以降低肝癌細胞內源性Spsb1基因表達,可用于后期的基因功能研究。結論：成功構建人Spsb1基因的慢病毒shRNA干擾載體LV3-Spsb1并包裝出其慢病毒顆粒。